上一期我們介紹了 物質(zhì)平衡試驗(yàn)的目的、試驗(yàn)的準(zhǔn)備以及試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，這一期我將繼續(xù)介紹如何對(duì)我們?cè)谂R床操作中收集的樣品進(jìn)行處理，如何進(jìn)行分析、如何對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估等。

到現(xiàn)在為止，我們獲得了所有受試者的血樣、尿樣和糞便樣品，其中糞便樣品需要與水混合以1:2或1:3的比例進(jìn)行  混合，制成勻漿。在血樣的樣本檢測(cè)之前，需要對(duì)樣本進(jìn)行合并處理（pooled）。一般有三種合并方法：同一受試者合并，同一采樣點(diǎn)合并以及全部合并。第一種方法就是將同一受試者的全部采樣點(diǎn)合并在同一個(gè)樣本中，這樣可以獲得整個(gè)回收期間各藥物相關(guān)物質(zhì)的占比等數(shù)據(jù)，也可以比較不同受試者之間的差異性。類似的第二種方法是在同一個(gè)采樣點(diǎn)或采樣周期，將所有受試者的樣本按同比例混合（即每受試者取一小份），這樣可以觀察每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各藥物相關(guān)物質(zhì)的變化情況，非常具有參考價(jià)值，但同時(shí)也是最耗費(fèi)時(shí)間和儀器的。第三種方法是最省時(shí)間和成本的，是將所有受試者每個(gè)采樣點(diǎn)按比例混合并將所有采樣點(diǎn)合并獲得的。具體采用那種方法，得基于實(shí)際的數(shù)據(jù)需要和時(shí)間進(jìn)度來決定。對(duì)于排泄物的合并處理，一般是在每個(gè)采樣周期，按同比例混合每個(gè)受試者的樣品。

人體物質(zhì)平衡試驗(yàn)需要我們回收一定的放射性活性，這一比例一般為90%（總放射性），或者連續(xù)兩個(gè)采樣周期回收的排泄物放射性小于1%。當(dāng)然這個(gè)回收率并不是強(qiáng)制性要求，它意味著如果回收率在這之下，需要對(duì)試驗(yàn)的設(shè)計(jì)操作以及分析過程進(jìn)行一定的評(píng)估，最終應(yīng)該得出一個(gè)可能的結(jié)論以說服監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)低回收率的接受。對(duì)放射性的檢測(cè)傳統(tǒng)上采用液體閃爍計(jì)數(shù)器（LSC）進(jìn)行試驗(yàn)過程中的實(shí)時(shí)檢測(cè)，確保我們回收了足夠的放射性。許多的物質(zhì)平衡試驗(yàn)都是通過LSC進(jìn)行檢測(cè)，比如輝瑞的蘆卡帕利、諾華的卡馬替尼等。這一過程可能需要使用我們最開始準(zhǔn)備藥品過程中獲得的DPM/ng，也就是每分鐘計(jì)數(shù)/ng的數(shù)值來進(jìn)行計(jì)算。

代謝物譜的檢測(cè)一般是使用HPLC方法進(jìn)行分離檢測(cè)的，分為離線和在線檢測(cè)兩種方法。離線檢測(cè)是通過HPLC對(duì)樣本進(jìn)行分離，隨后收集不同時(shí)間產(chǎn)出的小份樣本，隨后可以使用串聯(lián)質(zhì)譜，流式閃爍分析儀（FSA），加速器質(zhì)譜（AMS）進(jìn)行結(jié)構(gòu)信息的或放射性信息的收集。而在線檢測(cè)則是HPLC和串聯(lián)質(zhì)譜以及放射性分析儀器進(jìn)行聯(lián)用，從HPLC分離的樣本通過分流器按比例進(jìn)入兩種儀器同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。在樣本分析的過程中，我們一般通過放射性計(jì)數(shù)而非峰面積計(jì)算物質(zhì)的含量，這樣更加準(zhǔn)確，并且不需要儀器針對(duì)每一種化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行校正。選擇哪種放射性檢測(cè)方法主要與放射性活度有關(guān)。

禮來正在研發(fā)中的小分子BACE抑制劑LY3202626的物質(zhì)平衡試驗(yàn)中，由于其血漿放射性太弱（給藥劑量100μCi），所以采用了AMS方法幫助建立了其代謝物譜。其504h的排泄物收集時(shí)間僅僅獲得了75%的總回收率，提示LY3202626消除過程極其緩慢。其血漿放射性半衰期為32.5h，原型半衰期僅為24.5h，所以血漿中存在長(zhǎng)半衰期的代謝物。同時(shí)，禮來認(rèn)為，代謝物可能經(jīng)由肝腸循環(huán)，通過腸道菌群去結(jié)合被重新吸收，從而大幅延長(zhǎng)了半衰期。

對(duì)血樣的分析可以讓我們獲得許多信息，如循環(huán)的代謝物譜，循環(huán)中代謝物的含量與占比。我們需要重點(diǎn)關(guān)注的是不成比例的藥物代謝物。什么叫不成比例的藥物代謝物呢，根據(jù)FDA藥物代謝物安全性測(cè)試（Safety Testing of Drug Metabolites – Guidance for Industry）中的定義，不成比例的藥物代謝物指的是僅在人體內(nèi)出現(xiàn)的代謝物或者在人體內(nèi)的血漿濃度大于其在非臨床動(dòng)物研究中動(dòng)物體內(nèi)的血漿濃度的代謝物。一般來說重點(diǎn)應(yīng)該關(guān)注占總藥物相關(guān)暴露度10%以上（以穩(wěn)態(tài)AUC計(jì)算）的不成比例的藥物代謝物。在樣本分析的過程中，如果我們發(fā)現(xiàn)某代謝物是不成比例的藥物代謝物，而且其還占總暴露度AUC的10%以上，我們就可能需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。分情況討論，如果代謝物是人類特有的，則必須開展額外的非臨床試驗(yàn)，如果不是人類特有的但是血漿濃度已經(jīng)大于前期開展的非臨床動(dòng)物體內(nèi)的濃度的話，也應(yīng)該開展非臨床試驗(yàn)以覆蓋代謝物的人體血漿濃度。如果前期非臨床試驗(yàn)所測(cè)試的代謝物濃度范圍已經(jīng)覆蓋了人體的血漿濃度，則無需開展更多的研究。需要注意的是，這個(gè)10%的界限應(yīng)該根據(jù)代謝物本身的特性進(jìn)行評(píng)估，比如對(duì)于�；�葡糖醛苷，由于其可以與生物大分子共價(jià)的結(jié)合，所以具備顯著的毒性，可以適當(dāng)降低10%的界值。同時(shí)，這些非臨床研究必須在III期臨床試驗(yàn)之前完成，這使得對(duì)物質(zhì)平衡研究的時(shí)間選擇有一定的要求。

如果在血樣的分析中我們發(fā)現(xiàn)，原型藥物的半衰期比放射性半衰期短，這意味著循環(huán)中存在長(zhǎng)放射性的代謝物，我們需要對(duì)其進(jìn)行分析，是否具有藥理毒理活性。如果屬于不成比例的代謝物，還應(yīng)該開展額外的非臨床研究。代謝物半衰期過長(zhǎng)，會(huì)不會(huì)在多次給藥過程中產(chǎn)生蓄積，會(huì)不會(huì)產(chǎn)生藥理毒理作用，這些問題都必須在III期臨床試驗(yàn)之前予以解決。

對(duì)血漿代謝物譜的識(shí)別應(yīng)該結(jié)合已有的前期研究數(shù)據(jù)，比如前期的臨床PK研究，體外酶學(xué)及DDI研究等，有助于我們對(duì)代謝物譜的識(shí)別。對(duì)于主要的代謝物，如AUC占比超過25%或其活性占比超過10%的情況下，需要有相應(yīng)的體外DDI數(shù)據(jù)進(jìn)行支持，包括主要的I相代謝酶（P450等）。如果代謝物是直接II相代謝的產(chǎn)物，則考慮研究其與UGT酶家族（如UGT1A1和UGT2B7等）的相互作用。一般來說這些應(yīng)該在臨床前的體外酶學(xué)和DDI研究中進(jìn)行分析。

對(duì)排泄物樣本的分析主要回答如下幾個(gè)問題：有多少藥物從經(jīng)由糞便排泄？有多少藥物經(jīng)由腎臟途徑排泄？排泄物的代謝物譜如何？藥物的排泄途徑是啥？藥物的消除機(jī)理是啥？而這些問題會(huì)提升我們對(duì)藥物本身的理解，同時(shí)也會(huì)指導(dǎo)我們特殊人群的用藥。舉個(gè)例子，如果腎臟途徑是主要的排泄途徑，說明藥物吸收的程度高，尿液回收放射性的比值+血漿放射性比值與總放射性的比值，其實(shí)就代表了藥物吸收率（Fa）的下限值。為什么是下限值呢，因?yàn)榧S便中的放射性不一定來源于吸收后的藥物，可能是沒有吸收的藥物，可能是在腸道內(nèi)代謝形成的代謝物。這就是為什么推薦在進(jìn)行口服人體物質(zhì)平衡的試驗(yàn)的同時(shí)增加靜注的物質(zhì)平衡試驗(yàn)。這樣可以直接計(jì)算出真實(shí)的藥物吸收率。特別是如果糞便中的原型藥物占比較高的情況下，建議開展絕對(duì)生物利用度研究的同時(shí)，可以考慮開展藥物在糞便中的穩(wěn)定性，評(píng)估其是否可能在腸腔內(nèi)被代謝。另外，對(duì)吸收率的評(píng)估也有助于BCS的生物豁免申請(qǐng)。ICH M9R2中對(duì)滲透性的定義，絕對(duì)生物利用度大于85%或者尿液中原型藥物回收率大于85%或尿液中原型+I相氧化代謝物+II相結(jié)合代謝物的總和回收率大于85%的情況下，可以被定義為高滲透性。

下面我們舉個(gè)例子以說明Fa對(duì)我們分析藥物消除機(jī)制的重要性：

上面這張圖片展示了某藥物的消除機(jī)制，可以看到原型藥物在糞便中占到了50%的放射性，在不知道Fa的情況下，這50%的放射性可能來自于兩個(gè)方面：1. 藥物口服后沒有完全吸收，直接隨著糞便排出體外；2. 藥物被吸收，但由通過膽汁排泄或腸壁分泌的方式排入腸腔內(nèi)。我們假設(shè)通過絕對(duì)生物利用度試驗(yàn)或者靜注的物質(zhì)平衡試驗(yàn)得到了Fa的值，當(dāng)Fa=100%的時(shí)候，藥物完全被吸收，也就是說糞便中所有的原型藥物都是通過膽汁排泄或者腸壁分泌，這個(gè)時(shí)候需要注意是否有p-gp或BCRP的DDI。當(dāng)Fa=50%，糞便中所有的原型藥物都是沒有被吸收的，所以其他的消除途徑變?yōu)橹饕�的消除途徑，這個(gè)時(shí)候建議分析相應(yīng)路徑的代謝酶和轉(zhuǎn)運(yùn)體的DDI。

正如上面例子所示，藥物的排泄過程與轉(zhuǎn)運(yùn)體息息相關(guān)，常見的與藥物相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體包括：p-糖蛋白（p-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATP1B1/1B3）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OAT1/3）、有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OCT2）等。通過對(duì)排泄數(shù)據(jù)的分析，可以提供一定的提示來指導(dǎo)是否應(yīng)該開展相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)體的體外研究。參考FDA臨床藥物相互作用-細(xì)胞色素P450酶以及轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物相互作用指南（Clinical Drug Interaction Studies-Cytochrome P450 Enzyme- and Transporter-Mediated Drug Interactions – Guidance for Industry）：

• 如果有證據(jù)表明腸道吸收、膽汁排泄或者腎臟主動(dòng)排泄對(duì)PK參數(shù)的變異性有顯著貢獻(xiàn)的情況下，應(yīng)該考慮研究p-gp和BCRP介導(dǎo)的DDI。如果我們開展了口服和靜注的物質(zhì)平衡研究，是可以得出腸壁分泌和膽汁排泄對(duì)原型藥物的排泄具有什么樣的影響，因?yàn)殪o注情況下，只有這兩種方式可能會(huì)使得原型藥物出現(xiàn)在糞便中。所以，當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)這兩種方式對(duì)原型藥物的排泄具有顯著的作用，那么對(duì)p-gp和BCRP等腸壁常見外排蛋白的DDI研究就顯得十分必要。

• 又如有證據(jù)表明肝臟消除或膽汁排泄是藥物主要的消除途徑的話，并且藥物本身特性決定了其被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)程度小，肝臟組織有蓄積現(xiàn)象等情況，那么應(yīng)該考慮有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（如OATP1B1/1B3）介導(dǎo)的DDI，因?yàn)镺ATP家族是肝細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的主要轉(zhuǎn)運(yùn)受體。

• 有證據(jù)表明藥物經(jīng)過顯著的腎臟主動(dòng)排泄過程（比如滲透性差或溶解性差卻具有比較高的尿液回收率，占到了全身清除率的25%以上），考慮有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（OAT1/3）以及多藥及毒性化合物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體（MATE）介導(dǎo)的DDI。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體都是將藥物從血液轉(zhuǎn)移至尿液的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體。

在開展體外DDI試驗(yàn)之后，如果有必要可以考慮繼續(xù)開展體內(nèi)DDI試驗(yàn)，以研究這些相互作用在體內(nèi)的重要性，應(yīng)在III期臨床開展之前完成相應(yīng)的研究。

最后闡述一下人體物質(zhì)平衡研究開展的時(shí)機(jī)，目前各國(guó)并沒有指導(dǎo)原則或法律法規(guī)規(guī)定了此研究開展的時(shí)機(jī)，在去年12月，CDE發(fā)布了《創(chuàng)新藥臨床藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，其中提到，物質(zhì)平衡研究通常在確證性臨床前完成（III期臨床），建議在早期臨床中盡早開展相關(guān)研究。從另一個(gè)角度來說，物質(zhì)平衡研究的結(jié)論對(duì)其他如DDI研究，長(zhǎng)期致癌性試驗(yàn)等需要在III期臨床之前或者與III期臨床同步開展的研究有重要的指導(dǎo)作用。所以一般來說，物質(zhì)平衡試驗(yàn)在初步判斷化合物具有有效性之后就可以開展了，比如Ib期或者IIa期。綜合考慮物質(zhì)平衡試驗(yàn)的成本因素，在獲得有效性數(shù)據(jù)之前開展風(fēng)險(xiǎn)較大。2021年是我國(guó)創(chuàng)新藥百花齊放的一年，CDE共收到創(chuàng)新藥申請(qǐng)1400余項(xiàng)，化藥800余個(gè)，其中絕大多數(shù)都應(yīng)開展了人體物質(zhì)平衡試驗(yàn)。了解到物質(zhì)平衡試驗(yàn)的重要性，希望這篇文章可以給予大家對(duì)物質(zhì)平衡試驗(yàn)一個(gè)基本的認(rèn)識(shí)，在實(shí)際的試驗(yàn)過程中，關(guān)注藥物本身的特點(diǎn)，靈活的設(shè)計(jì)試驗(yàn)，從而提供更多優(yōu)質(zhì)有效的信息，助力新藥的臨床研究。

1. 王璐, 張澤茹,and 邵鳳."~(14)C標(biāo)記人體物質(zhì)平衡研究設(shè)計(jì)和結(jié)果簡(jiǎn)介." 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志 37.05(2021):568-571. doi:10.13699/j.cnki.1001-6821.2021.05.018.

2. 王璐, 張澤茹,and 邵鳳."~(14)C標(biāo)記人體物質(zhì)平衡研究設(shè)計(jì)和結(jié)果簡(jiǎn)介." 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志 37.05(2021):568-571. doi:10.13699/j.cnki.1001-6821.2021.05.018.

3. 孫魯寧, et al."創(chuàng)新藥人體物質(zhì)平衡與代謝研究同位素示蹤技術(shù)平臺(tái)建設(shè)的實(shí)踐與思考." 中國(guó)新藥雜志 30.17(2021):1570-1573. 

4. 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局, “創(chuàng)新藥臨床藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則”, 2021

5. 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局, “藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則”, 2021

6. Penner, Natalia et al. "Human Radiolabeled Mass Balance Studies: Objectives, Utilities And Limitations". Biopharmaceutics & Drug Disposition, vol 30, no. 4, 2009, pp. 185-203. Wiley, https://doi.org/10.1002/bdd.661.

7. Roffel, A.F. et al. "An Evaluation Of Human ADME And Mass Balance Studies Using Regular Or Low Doses Of Radiocarbon". Journal Of Labelled Compounds And Radiopharmaceuticals, vol 59, no. 14, 2016, pp. 619-626. Wiley, https://doi.org/10.1002/jlcr.3473.

8. U.S. The Administrative Committee of the Federal Register. "Code Of Federal Regulations Title 21，Part 361． 1: Radioactive Drugs For Certain Research Uses". Ecfr.Gov, 2022, https://www.ecfr.gov/current/title-21/chapter-I/subchapter-D/part-361/section-361.1.

9. U.S.  Department of Health and Human Services，F(xiàn)ood and Drug Administration，Center for Drug Evaluation and Research，Center for Biologics Evaluation and Research． The Radioactive Drug Research Committee: Human Research Without An Investigational New Drug Application, Aug 2010, https://www.fda.gov/media/76286/download, Accessed 19 Feb 2022.

10. ICRP, 1992. Radiological Protection in Biomedical Research. ICRP Publication 62. Ann. ICRP 22 (3).

11. Penner, Natalia et al. "Radiolabeled Absorption, Distribution, Metabolism, And Excretion Studies In Drug Development: Why, When, And How?". Chemical Research In Toxicology, vol 25, no. 3, 2012, pp. 513-531. American Chemical Society (ACS), https://doi.org/10.1021/tx300050f.

12. U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Center for Biologics Evaluation and Research, Safety Testing of Drug Metabolites, Mar 2020, https://www.fda.gov/media/72279/download, Accessed 19 Feb 2022.

13.Spracklin,DouglasK.etal."Mini‐Review: Comprehensive Drug Disposition Knowledge Generated In The Modern Human Radiolabeled ADME Study". CPT: Pharmacometrics & Systems Pharmacology, vol 9, no. 8, 2020,pp.428-434.Wiley, https://doi.org/10.1002/psp4.12540.

14. Katyayan, Kishore et al. "Excretion, Mass Balance, And Metabolism Of [14C]LY3202626 In Humans: An Interplay Of Microbial Reduction, Reabsorption, And Aldehyde Oxidase Oxidation That Leads To An Extended Excretion Profile". Drug Metabolism And Disposition, vol 48, no. 8, 2020, pp. 698-707. American Society For Pharmacology & Experimental Therapeutics (ASPET), https://doi.org/10.1124/dmd.120.000009.

15. Liao, Mingxiang et al. "Evaluation Of Absorption, Distribution, Metabolism, And Excretion Of [14C]-Rucaparib, A Poly(ADP-Ribose) Polymerase Inhibitor, In Patients With Advanced Solid Tumors". Investigational New Drugs, vol 38, no. 3, 2019, pp. 765-775. Springer Science And Business Media LLC, https://doi.org/10.1007/s10637-019-00815-2.

16. Glaenzel, Ulrike et al. "Absorption, Distribution, Metabolism, And Excretion Of Capmatinib (INC280) In Healthy Male Volunteers And In Vitro Aldehyde Oxidase Phenotyping Of The Major Metabolite". Drug Metabolism And Disposition, vol 48, no. 10, 2020, pp. 873-885. American Society For Pharmacology & Experimental Therapeutics(ASPET), https://doi.org/10.1124/dmd.119.090324.